PRACTIQUES D'ENGINYERIA GENÈTICA
CURS 1995-1996
CALENDARI
Les pràctiques consistiran en:
Detecció de polimorfismes d'ADN mitocondrial mitjançant RFLPs. Per la qual serà necessari la utilització de les següents tècniques:
1-Extracció d'ADN humà a partir de sang.
2-Digestió de l'ADN mitjançant enzims de restricció (BamHI, Ava II, Hae i Hpa)
3-Electroforesi en gel d'agarosa
4-Transferència de l'ADN a membrana de niló (Southern Blotting).
5-Hibridació amb una sonda de ADN mitocondrial
6-Detecció de les bandes
7-Marcatge de la sonda.
| DILLUNS | DIMARTS | DIMECRES | DIJOUS | DIVENDRES |
| Extracció d'ADN humà | Extracció i quantificaciód'ADN
Digestió de l'ADN amb enzims de restricció | Marcatge de la sonda
Electroforesi de l'ADN | Marcatge de la sonda
Transferència Prehibridació Hibridació | Detecció de les bandes |
POLIMORFISMES DE L'ADN MITOCONDRIAL MITJANÇANT RFLPS
Totes les molècules de mtDNA d'un individu solen ser idèntiques (homoplasmia). Així doncs, es pot dir que els humans són haploids respecte al nombre de diferents tipus d'ADN mitocondrial per cèl.lula, encara que poliploids respecte al nombre de molècules (milers per cèl.lula).S'ha demostrat que el mtDNA és d'herència materna, donat a la preponderància de mtDNA en l'oòcit respecte a l'espermatozou.
El mtDNA evoluciona de 5 a 10 vegades més ràpid que el DNA nuclear, degut a que la mitocòndria no té enzims repadadors d'errades en la replicació ni de danys de l'ADN, i, per una altra banda, a que moltes mutacions poden ser tolerades i fixades degut a forces relaxadores en l'aparell traduccional.
Per analitzar la variabilitat del mtDNA es poden utilitzar dos mètodes principals: RFLPs o seqüenciació directe. En aquesta pràctica es faran RFLPs de la següent manera: extracció d'ADN total a partir de sang, digestió d'aquest amb enzims de restricció, separació dels fragments obtinguts en un gel d'agarosa, que seran posteriorment transferits a una membrana de nylon, i detecció dels fragments que corresponen a ADN mitocondrial mitjançant una sonda específica de mtDNA.
L'estudi del mtDNA s'ha aplicat entre altres
en el camp de la Genètica de poblacions, en el de l'Antropologia,
a la recerca de l'origen de l'Home, i a l'estudi de determinades
malalties.
ESQUEMA DEL PROCEDIMENT:
SANG--->Extracció-->Digestió-->Electroforesi-->Transferència------->Hibridació-->Revelat
Bacteris-->Extracció plàsmid-->Digestició----->Marcatge i constitució---
i quantificació de la sonda
1-EXTRACCIO DNA GENOMIC HUMA
Mètode d'extracció, purificació i quantificació de DNA genòmic humà a partir de leucòcits de sang perifèrica.
EXTRACCIO
1.- Rentar 10 ml. de sang perifèrica (recollida en tubs que portin EDTA-K3) en sèrum fisiològic fins un volum final d'uns 12-15 ml.
2.- Centrifugar 15 minuts a 3000-3500 rpm.
3.- Rebutjam el sobrenadant (congelam el paquet cel.lular en cas de no voler utilitzar-lo en el moment).
4.- Afegir al paquet cel.lular aigua destil.lada, per tal de rompre els eritròcits, fins un volum final de 12 ml. Agitam cuidadosament fins l'homogenització completa de la mostra.
5.- Centrifugar 10 minuts a 3000 rpm.
6.- Rebutjar el sobrenadant amb pipeta Pasteur fins a uns 2 ml. Repetir el punts 4 i 5 en cas de que el pellet resultant no sigui blanc del tot.
7.- Afegir al pellet Nonidet p-40 al 0.1% fins un volum final d'uns 12 ml. Mesclam suaument.
8.- Centrifugar durant 15 minuts a 3500 rpm i eliminar el sobrenadant. Disgregar el pellet amb vortex.
9.- Afegir 5 ml. de solució A al pellet i agitar vigorosament.
10.- Afegir Proteinasa K un volum de 100 ml (20 ml/ml), preparada a una concentració de 10 mg/ml. Potser millor afegir una mica més per una millor efectivitat, sobre tot si utilitzam proteinasa K vella.
11.- Deixar durant tota la nit al bany a 37ºC (ó a 50ºC 3h).
PURIFICACIO
12.- Afegir v/v la mescla de fenol*/(cloroform/isoamílic)**
(1v*/1v**) **= 24 ml/1ml.
13.- Centrifugar 10 minuts a 3000 rpm.
14.- Rebutjar la fase inferior i passar la fase superior a un altre tub.
15.- Repetir els punts 12, 13 i 14.
16.- Afegir la mescla v/v de cloroform/isoamílic**.Agitar vigorosament.
17.- Centrifugar durant 10 minuts a 3000 rpm.
18.- Rebutjar la fase inferior i tornam passar la superior a un altre tub.
19.- Repetir els punts 16 i 17 un altra vegada. Passar la fase superior a un altre tub anant en cura de no passar part fenòlica.
PRECIPITACIO
20.- Afegir NaCl 5M (400 ml per cada 5 ml de solució). Agitar.
21.- Afegir etanol absolut fred (2 volums) i invertir fins veure el DNA.
22.- Centrifugar 10'-20' a 4000 rpm per precipitar el DNA.
23.- Decantar la fase líquida (bomba d'aigua).
24.-Afegir etanol al 70%.
25.- Centrifugar 10'-20' a 4000 rpm per precipitar el DNA.
26.- Decantar la fase líquida (bomba d'aigua).
27.-Secar al pellet a la bomba de buit durant 1 min.
28.- Després, afegir de 50 ml
a 100 ml
de TE a pH=7.5 segons la quantitat de DNA.
QUANTIFICACIO
23.- Fer una disolució 1:20 de la solució de DNA que es té. Es a dir, diluir 1-5 ml de la solució de DNA dins 69-65 ml d'aigua destil.lada.
24.- LLegir les D.O. a 260 nm i a 280nm, posant
primerament una cubeta d'aigua destil.lada per donar la referència
al DNA Quant. Calcular la concentració i la puresa.
SOLUCIONS
Sol.A: 20
ml NaCl 5M, 100 ml EDTA 0.25M ph=8, 50 ml SDS 10%, H2O
fins 1000 ml.
2-DIGESTIO DEL DNA AMB ENZIMS DE RESTRICCIO
1. Anar a cercar gel per mantenir en fred els enzims de restricció degut a que no poden estar a temperatura ambient.
2. Treure de la gelera els enzims de restricció, i posar l'enzim dins gel i el tampó a temperatura ambient per a que es descongeli.
3. Treure també la RNAasa i deixar-la a temperatura ambient.
4. Dins un eppendorf posam en el següent ordre:
a. 1.6 ml de tampó
b. 1 ml de RNAasa
c. x ml d'aigua destil.lada i autoclavada
d. x ml del DNA (3 mg d'ADN)
e. 1 ml d'enzim de restricció
NOTA: El volum x d'aigua es refereix al volum necessari per tenir un volum final de 16ml. D'aquesta manera, afegirem després de la digestió 4 ml de "loading buffer " (tampó de càrrega) per carregar un total de 20 ml al gel.
5. Donam un cop de centrífuga i incubam
a 37ºC un mínim de 2-3 hores (o tota la nit).
3-ELECTROFORESI EN GELS D'AGAROSA.
Nota: emprar guants, tot el material està contaminat amb bromur d'etidi.M1. Tancar les voreres del llit d'electroforesi imb cinta d'embalar. Col.locar la pinta.
2. Preparar el gel d'agarosa al 1.5%.
Per a 175 ml. totals Per a 40 ml. totals
ml. H2O dest. 171.5 39.2
ml. TAE 50X 3.5 0.8
grams agarosa 2.6 0.6
3. Encalentir el gel fins que bulli.
4. Posar el "DNA marker II" a 65ºC uns 30 minuts.
5. Deixar refredar el gel fins a uns 60ºC.
6. Afegir 5 ml de bromur d'etidi per 100 ml de gel (10 mg/ml).
7. Abocar el gel al llit abans que refredi. Llevar bé les bimbolles. Deixar refredar a temperatura ambient.
8. Llevar la cinta d'embalar del llit d'electroforesi. Posar el llit dins la cubeta.
9. Abocar TAE 1X dins la cubeta fins que el gel quedi suficientment cubert.
10. Llevar la pinta i carregar les mostres (16ml de mostra + 4ml de tambó de càrrega) i el marcador (4 ml de mostra + 1ml de tambó de càrrega). La punta de la pipeta s'ha de sumergir en el tampó però no ha de tocar el gel. La mostra es deixa caure lentament en el pouet.
11. Condicions de l'electroforesi (són variables segons tamany de la cubeta, etc). En cas d'utilitzar la cubeta petita les condicions són:
Voltatge: 50 mV.
Temps: unes 2 hores, però sempre cal
controlar.
4-TRANSFERENCIA A MEMBRANES DE NILO (SOUTHERN BLOTTING).
Nota: abans de començar comprovar que hi ha suficient volum de les solucions I, II i III i preparar l'equip per a la transferència (cubeta, vidres, paper Whatmann 3M, pes i tovalloles).
1. Aturar l'electroforesi i comprovar que el DNA ha corregut suficientment (transil.luminador). Fer una marca al gel allà on es troba el marcador.
2. Tallar els fragments de gel que no contenen DNA i depositar-los en els contenidors de materials contaminants. Mesurar el fragment de gel que queda.
3. Submergir el gel en solució I durant 7 minuts, en agitació.
4. Tirar la solució I i rentar el gel amb aigua autoclavada.
5. Submergir el gel en solució II (desnaturalitzant) durant 30 minuts, en agitació.
6. Tirar la solució II i rentar el gel amb aigua autoclavada.
7. Submergir el gel en solució III (neutralitzant) durant 30 minuts, en agitació.
8. Tallar un fragment de membrana de nylon (Hybond-N) i dos fragments de paper Whatmann de les mateixes dimensions del gel. Submergir els tres fragments en 3X SSC.
9. Preparar l'equip de transferència. Preparar 1 litre de 10X SSC. Col.locar un vidre sobre la cubeta. Tallar un fragment de paper Whatmann de doble dimensió que el vidre, banyar-lo en 10X SSC i col.locar-lo sobre el vidre procurant que no quedin bimbolles. Abocar la resta de 10X SSC en la cubeta. Preparar tovalloles, vidre i pes.
10. Tirar la solució III i rentar amb aigua autoclavada.
11. Col.locar el gel en el plat de transferència. La part d'abaix del gel s'ha de trobar en contacte amb la membrana. Col.locar la membrana sobre el gel, procurant que no quedin bimbolles. Col.locar els dos fragments de paper Whatmann sobre la membrana. Col.locar les tovalloles sobre els filtres i posar vidre i pes damunt les tovalloles.
12. Canviar les tovalloles humides cada 5-15 minuts, sobretot durant la primera hora. Transferir un mínim de 2-3 hores (millor tota la nit).
13. Al final de la transferència llevar les tovalloles i marcar amb llapis la vorera de la membrana on es troba el marcador. Submergir la membrana en 3X SSC i deixar secar sobre un paper Whatmann a temperatura ambient. Embolicar la membrana en plàstic adherent procurant que quedi el més llis possible.
14. Irradiar la membrana amb UV durant 5 minuts per la cara en la que es troba transferit el DNA.
SOLUCIONS PEL SOUTHERN.
Solució I: 0.25 M HCl: 21.8 ml. HCl en 1 litre aigua destil.lada.
Solució II: 58.44 grams NaCl, 50 ml. 10M NaOH en 1 litre aigua destil.lada. Autoclavar.
Solució III:
175 grams NaCl, 500 ml. Tris-HCl 1M, pH=7.4, fins a un litre amb
aigua destil.lada. Autoclavar.
5-HIBRIDACIO AMB SONDA DE DNA MITOCONDRIAL
1. Pre-hibridar el filtre en un tub d'hibridació amb la solució de pre-hibridació a 68ºC al menys una hora. No deixar bimbolles d'aire entre la membrana i les parets del tub d'hibridació. Col.locar la cara del filtre que conté el DNA cap a la llum del tub.
2. Canviar la solució de pre-hibridació (que es sol tirar) per la solució de hibridació*. Deixar a 68ºC tota la nit.
3. Recuperar la solució de hibridació per reutilitzarla, i guardarla al congelador.
4. Realitzar dos rentats de 5 minuts a temperatura ambient preparant 100 ml de la solució I (composició en la taula).
5. Després realitzam dos rentats de 15 minuts amb uns altres 100 ml de solució II (taula). En aquests rentats hi posarem unes condicions restrictives variables suposant segons el cas distints % d'homologia al DNA. En el cas del mtDNA les condicions seran de 55ºC i 0.1% SSC, presuposant així un 90% d'homologia. Degut a que necessitam 55ºC es posarà prèviament al bany per a que al moment de fer els rentats estigui a la temperatura correcta. Les condicions d'aquest segon rentat podran variar segon la taula d'homologies. Durant aquests rentats es col.locarà el filtre amb la cara que conté el DNA cap adalt.
6. Els filtres podran ser guardats secats al aire o ser utilitzats per una detecció inmunològica directament.
* Abans de posar la solució de hibridació, aquesta ha de bolir durant 10 minuts, i inmediatament després ha de posar-se en gel per evitar que les cadenes es renaturalitzin.
Solució de pre-hibridació:
Per preparar 100 ml les proporcions són les següents:
SDS (10%) 0.2 ml
SSC (20x) 25 ml
N-lauroyl-sacarosine (35%) 0.286 ml
Blocking 1 gr
Duim fins a un volum final de 100 ml amb aigua destil.lada.
Atenció! Primer posar el SDS, després un poc d'aigua i finalment el SSC ja que sino precipita.
Calentar durant una hora fins que els grums es desfaguin a 50-70ºC controlant de que la temperatura no passi.
Solució d'hibridació:
- Per cada ml de solució de pre-hibridació disoldrem 25 ng de sonda marcada. Es a dir, disoldrem 2.5 ml de sonda marcada per ml de solució de prehibridació.
- Per cada filtre utilitzarem 4 ml de solució d'hibridació, així hi disoldrem 10 ml de sonda marcada.
- La solució d'hibridació`pot reutilitzar-se, encara que si ha estat sotmesa a molts d'usos, és recomanable afegir-li una mica de sonda marcada.
Solucions pels rentats de les membranes
Quantitats per a preparar 100 ml de solució:
| Stocks | Solució I (T.ambient) | Solució II (55ºC)* |
| SSC (20x) | SSC(2x) 10 ml | SSC(0.5x) 2.5 ml |
| SDS (10%) | SDS(0.1%) 1 ml | SDS(0.1%) 1 ml |
| Fins a 100 ml amb H2O destil.lada | ||
* La solució II que s'utilitza a 55ºC
convé posar-la amb temps d'antelació al bany per
a que a l'hora de posar-la als filtres ja estigui a 55ºC.
6-DETECCIO INMUNOLOGICA
1. Rentar els filtres breument amb Tampó I. El Tampó I es té concentrat 5x però s'utilitza a concentració 1x. Després del rentat es tira.
2. Incubar amb agitació els filtres amb uns 100 ml de Tampó II durant una hora.
3. Rentar breument amb Tampó I.
4. Diluir anticós-conjugat en Tampó I (veure preparació de disolució de anticós). La solució d'anticós pot reutilitzar-se afegint una mica d'anticós a la solució ja utilitzada.
5. Incubar amb agitació una hora amb 30 ml de solució d'anticós.
6. LLevar l'anticós, guardant-lo per usos posteriors, i rentar 2x15 minuts amb Tampó I.
7. Equilibrar amb Tampó III durant 2 minuts.
8. Incubar en 20 ml de solució de color en una capsa de plàstic opaca a 37ºC, tapada amb paper d'alumini. Col.locar el filtre amb la cara que conté el DNA cap a baix.
9. Una vegada es van observant les bandes, s'atura la reacció amb Tampó IV.
Solucions per la detecció immunològica
Tampó I. Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5.Per a tenir-lo a 5x:
1 M Tris- HCl: 500 ml, o bé, 60.55 de Tris base.
5 M NaCl: 150 ml, o be, 43.93 g de NaCl.
Ajustar el pH, aforar a un litre i autocavar.
NOTA: Recordar que es té a 5x i s'utilitza a 1x.
Tampó II. Disoldre 1 g de blocking (LLet en pols desnatada) en 100 ml de Tampó I. Es pot guardar a la nevera durant uns dies.
Tampó III. Tris-HCl 100mM, NaCl 100mM, MgCl2 50 mM, pH 9.5.
Disoldre 12.1 g de Tris base, 20 ml de NaCl 5M, 10.17 g de MgCl2 x 6H2O. Ajustar el pH, aforar a un litre i autoclavar. Aquest tampó III no s'ha de diluir, s'utilitza tal com es prepara. NOTA: Abans d'utilitzar-lo, agitar be la botella degut a que el NaCl precipita.
Tampó IV. T.E. (1x).
Solució de color. Disoldre 90 ml de solució NBT i 70 ml de solució x-fosfat en 20 ml de tampó III. Es pot treure de la nevera durant el procés de preparació de la solució de color.
Disolució d'anticós. Posar 6 ml d'anticós per cada 30 ml de Tampó I.NOTA: Preparar en el moment.
CARACTERISTIQUES DE LA SONDA
Fotocòpia de la sonda
7.- MARCATGE DE LA SONDA.
1. Preparar un ìbany mariaî a uns 95º C i anar a cercar gel.
2. Posar en un eppendorf 300 ng. del DNA que es vol marcar, purificat i linearitzat (300 ng. és la quantitat de partida amb la que síobté el major rendiment: partint de 300 ng. síobtenen 500 ng. de DNA marcat).
3. Desnaturalitzar aquest DNA, deixant el tub eppendorf al bany maria uns 10 minuts. Nota: aquest eppendorf s´ha de fer bollir amb el tap girat, per a que no síobri.
4. Passats els 10 minuts díebullició, posar líeppendorf immediatament en gel, per evitar la renaturalització de les cadenes. Es deixa uns 5 minuts en gel.
5. Després dels cinc minuts, es dóna un cop de centrífuga a líeppendorf i es torna posar immediatament en gel.
6. Al DNA desnaturalitzat síhi afegeix el següent:
1 ml. de mescla díhexanucleòtids
2 ml. de ìdNTP labeling mixtureî
7. Síafegeix aigua estèril fins a un volum de 19 ml.
8. Es dóna un cop de centrífuga a la mescla i es torna posar en gel.
9. Síafegeix a la mescla 1 ml. díenzim Klenow.
10. Síincuba al manco una hora (es recomana una incubació de 20 hores) a 37ºC.
11. Passades les 20 hores síafegeixen 2 ml. díEDTA 0.2 M (pH=8), per aturar la reacció.
12. Es precipita el DNA amb:
2.5 ml. de LiCl 4 M
75 ml. díetanol fred (-20ºC).
13. Es mescla bé amb el vórtex.
14. Es deixa líeppendorf a -70º C uns 30 minuts (es recomana una hora) o a -20º C tota la nit.
15. Es centrifuga 15 minuts a 15.000 g.
16. Es renta el precipitat amb 40 ml. díetanol 70%, fred.
17. Es centrifuga a 15.000 g, 5 minuts.
18. Se seca el precipitat a la bomba de buid, uns 5 minuts.
19. Es disol el precipitat en 50 ml. de TE. La concentració resultant és de 10 ng/ml (500 ng/50 ml).
CONSTITUCIO DE LA SONDA.
La sonda consta de una mescla equimolar de cinc fragments de mtDNA de diferent tamany que abarquen tota la mòlecula del DNA mitocondrial (veure figura). De cada fragment hi ha d'haver una concentració d'un mínim de 25 ng/ml de solució de pre-hibridació.
Depenent del tamany de cada fragment posarem una quantitat distinta per conseguir equimolaritat. Així, sabent que tenim els fragments a una concentració de 10ng/ml, posarem les següents quantitats per quatruplicat perquè ho reconstituïm dins 4 ml de solució de prehibridació: A 6.7ml 67ng, B 8.5ml 85ng
C 4.5ml 45ng D 3.37ml 34ng
E 2ml
20ng TOTAL 251ng