Laboratori de Genètica

Departament de Biologia Fonamental i C.S.

Facultat de Ciències

Universitat de les Illes Balears

PRACTIQUES D'EVOLUCIO

Curs1995-96

Pràctiques d'Evolució

1.-Tècniques immunohematològiques: determinació de grups sanguinis.

2.-Isoelectroenfocament (IEF) en sèrum humà: tipificació de la a1-Antitripsina, de la Transferrina i de la Gc.

3.-Tècniques d'electroforesi horitzontal en gels de midó: Haptoglobina.

4.-Polimorfisme del DNA mitocondrial (mtDNA) d'espècies de Drosophila..

CALENDARI

DILLUNS	DIMARTS	DIMECRES	DIJOUS	DIVENDRES
GRUPS SANGUINIS	IEF (PI, TF, GC)	ELECTROFO-RESI HP	MT DNA	MT DNA
PREPARACIO IEF	IEF (PI, TF, GC) PREPARAR ELECTROFO-RESI	CALCULS	MT DNA	MT DNA

1.-TECNIQUES IMMUNOHEMATOLOGIQUES: DETERMINACIO DE GRUPS SANGUINIS

La determinació de grups sanguinis té una important aplicació tant en clínica (transfusions, trasplantaments, incompatibilitat feto-materna), com en l'estudi de poblacions humanes des del punt de vista de la Genètica de Poblacions.

Es determinaran els fenotips dels sistemes de grups sanguinis ABO, Rh, Kell, Duffy, MNSs, Lewis i P, d'una mostra de sang, mitjançant les tècniques immunològiques que s'exposen a continuació.

SISTEMA ABO. Es determinarà per tècnica en porta la presència dels antígens A i B.

Reacció amb

Genotip Antígen Anti-A Anti-B Anti-AB

AO

AA A + - +

BO

BB B - + +

AB A+B + + +

OO ___ - - -

SISTEMA RH. Es determina per tècnica en porta la presència o absència de l'antígen D.

Genotip Antígen Reacció amb Anti-D

DD

Dd D +

dd ___ -

SISTEMA MNSs. Es un sistema amb dos loci bial.lèlics lligats. Es determinen en porta els antígens M i N, en tub el S, i per tècnica de Coombs indirecte el s. Reacció amb

Genotip Antígen Anti-M Anti-N

MM M + _

MN M+N + +

NN N - +

Reacció amb

Genotip Antígen Anti-S Anti-s

SS S + -

Ss S+s + +

ss s - +

SISTEMA DUFFY. Es determinen els antígens Fya i Fyb mitjançant el test de Coombs.

Reacció amb

Genotip Antígen Anti-Fya Anti-Fyb

FyaFya Fya + -

FyaFyb Fya + Fyb + +

FybFyb Fyb - +

SISTEMA LEWIS. Determinam la presència d'antígen Lea i Leb per tècnica en tub. La seva expressió es troba regulada de manera complexe per tres loci: H, Se, i Lewis.

Reacció amb

Genotip Antígen Anti-Lea Anti-Leb

Le- H- sese Lea + -

Le- H- Se- Leb - +

lele -- -- ___ - -

Als infants, el Le- H- Se pot expresar-se com Lea + Leb +. A adults rarament.

SISTEMA KELL. Es determina per test de Coombs la presència o absència de l'antígen K.

Genotip Antígen Reacció amb anti-K

kc kc (Cellano) kc -

K K K +

K kc K+kc +

SISTEMA P1. Es determina per tècnica en tub (40C) la presència o absència de l'antígen P1.

Genotip Antígen Reacció amb anti-P1

P1 p

P1 P1 p + P1 +

P1 P2

P2 P2

P2 p -

p p ___ -

PROTOCOL

1-Es parteix d'un volum de sang total (1-5 ml) recollida amb anticoagulant (EDTA generalment), i conservada a 40C un màxim de 36 hores.

2-Es preparen 4 "portas" i es posen 10 ml de sang total a cadascun. S'afegiran a continuació 10 ml d'anti-A al primer porta, 10 ml d'anti-B al segon, 10 ml d'anti-A+B al tercer, i 10 ml d'anti-D al darrer, mesclant-se bé amb un escuradents.

3-Passats un parell de segons (més en el cas del D) s'observa i anota la presència o no d'aglutinació.

4-Centrifugar el tub de sang total aproximadament 5' a 2300 rpm.

5-Eliminar el sobrenedant (sèrum) amb una pipeta Pasteur.

6-Afegir aprox. 10 volums de solució salina, i mesclar bé amb el sediment.

7-Centrifugar 5' a 2300 rpm

8-Eliminar el sobrenedant i la capa blanca superior del sediment (leucòcits).

9-Repetir el rentat fins que el sobrenedant quedi totalment transparent.

10-Preparar un tub eppendorf per a cada mostra amb 40 ml de solució salina, i 10 ml de sediment d'eritròcits (solució al 20%).

11-Posar 10 ml de la solució anterior sobre un porta i 10 ml d'anti-M. Mesclar-ho. A un altre porta el mateix però amb anti-N.

12-Esperar un minut (aprox.) i llegir.

13-Preparar un tub eppendorff amb 1 ml de solució salina i 40 ml d'eritròcits (2-5%).

14-Preparar 6 tubs per mostra amb 15 ml de l'anterior solució eritrocitària i afegir-hi per ordre 15 ml dels següents reactius: anti-S, anti-s, anti-K, anti-Fya i anti-Fyb.

15-Incubar els tubs a 370C durant 30'.

16-Mentrestant preparar un tub per mostra amb 15 ml de sol. eritrocitària i 15 ml d'anti-P1. Incubar-lo 15' a 40C.

17-Mentrestant posar a uns altres 2 tubs 10 ml de la solució eritrocitària 2-5% i afegir a un 20 ml d'anti-Lewis a i a l'altre 20 ml d'anti-Lewis b. Centrifugar immediatament aquests tubs 20" a 3500 rpm. Observar aglutinació contra fons blanc, amb un moviment rotatiu del tub i sense movimetns violents.

18-Transcorreguts els 15' (pas 16) centrifugar 1' a 1000 rpm i observar l'aglutinació com s'ha indicat anteriorment.

19-Transcorreguts els 30' (pas 15) treure els tubs de l'estufa i centrifugar 1' a 1000 rpm el tub S. Observar aglutinació. Igual amb el Lea.

20-Test de Coombs indirecte.

-Als tubs que queden afegir 10 volums de solució salina.

-Centrifugar 1' a 1000 rpm.

-Retirar amb una pipeta Pasteur de vidre tot el sobrenedant.

-Repetir el rentat 3 vegades.

-Afegir al sediment una gota d'antiimmunoglobulina humana.

-Centrifugar 1' a 1000 rpm.

-Llegir aglutinació sobre fons blanc.

SOLUCIO SALINA: 8.5 gr Cl Na/ 1 litro H2O.

4- Càlculs per a estimar les freqüències gèniques.

La llei de Hardy-Weinberg diu que en poblacions de tamany infinit amb aparellament a l'atzar, les freqüències gèniques es mantendran constants de generació en generació en absència de migració, mutació i selecció; estant les freqüències genotípiques determinades per les freqüències gèniques.

Les freqüències genotípiques d'equilibri venen donades pel quadre de les freqüències al.lèliques. Si hi ha només dos al.lels, A i a, amb freqüències p i q, les freqüències dels tres possibles genotips seran:

(p+q)2 = p2 + 2pq + q2

A a AA Aa aa

a on els al.lels i els genotips als que corresponen les freqüències estan escrits en segona línea.

Si hi ha tres al.lels, diguem A1, A2, A3, amb freqüències p, q i r, les freqüències genotípiques són:

(p + q + r)2 = p2 + q2 + r2 + 2pq + 2pr + 2qr

A1 A2 A3 A1A1 A2A2 A3A3 A1A2 A1A3 A2A3

S'ha de notar que la suma de totes les freqüències al.lèliques i de totes les freqüències genotípiques ha de ser sempre 1. Si hi ha només dos al.lels, amb freqüència p i q, llavors p+q = 1, i per tant p2 + 2pq + q2 = (p + q)2 = 1. Si hi ha tres al.lels, amb freqüències p, q i r, llavors p + q + r = 1, i per tant també (p + q + r)2 = 1.

En el sistema Lewis ( igual que als que presenten dominància, com són el Rh, Kell, i P), d'acord amb la llei de Hardy-Weinberg, la freqüència del genotip homocigot recessiu és q2, si anomenam le a la freqüència fenotípica dels individus Le negatius (freqüència absoluta dividida pel nombre d'individus):

q = &Atildele

I com p + q = 1 ¤ p = 1 - q

A la resta de sistemes els càlculs es fan pel mètode de recompte de gens, com a l'exemple següent:

Considerant els al.lels S i s, i les seves freqüències respectives p, i q, tendrem:

p= (2S + Ss)/2N

q= (2s + Ss)/2N

Sient S i s les freqüències fenotípiques absolutes, i N el nombre total d'individus.

L'error standard es calcula segons les fòrmules seqüents:

-en el cas de recompte de gens: Ãp(1-p)/2N

-en el cas de dominància: Ã1-q2/4N

2.-ISOELECTROENFOC EN SERUM HUMA PER A LA TIPIFICACIO DE L' a1- ANTITRIPSINA, LA TRANSFERRINA I LA GC.

L' a1-ANTITRIPSINA o "Protease Inhibitor" és una proteïna sèrica amb la funció d'inhibir distints tipus de proteases, sobretot l'elastasa neutròfila alliberada pels macròfags en procesos infecciosos. Aquesta elastasa neutròfila si no fos neutralitzada per la Pi atacaria al teixits .

Hi ha moltes variants al.lèliques, algunes d'elles deficients. Les més comuns a Europa són la S (60% d'activitat) i la Z (10% d'activitat). La gent portadora d'aquests al.lels pot desenvolupar emfisema pulmonar, cirrosi hepàtica o hepatitis neonatal.

L'IEF en el rang 4-6.5 ens separa en posició anòdica la Pi amb tres bandes principals i dues secundàries. El zimograma es mostra a continuació.

La Gc (Group especific component) és una proteïna sèrica amb funció de transportar vitamina D3 i els seus derivats. Les variants al.lèliques més comuns són la 1 i la 2.

L'IEF en el rang 4-6.5 presenta el següent zimograma:

Les dues bandes del fenotip 1 corresponen a dues cadenes idèntiques en quant a aminoàcids però unides a un nombre diferent de residus d'àcid siàlic.

La TF (Transferrina) és una glicoproteïna sèrica amb capacitat d'unió reversible al ferro. La seva funció principal és el transport de Fe dels llocs d'absorció intestinal i llocs de degradació de l'hemoglobina a llocs d'emmagatzemament o a cèl.lules amb especials requeriments de Fe. Las variants més comuns són la C1, C2 i C3.

Fenotips més comuns de la Trnasferrina

PROTOCOL DE FUNCIONAMENT DEL PHASTSYSTEM

1- SEPARACIO. (Treure mostres de sèrum del congelador)

1-Conectar els dos endolls.

2-ON. Botó darrera.

3-Esperar que aparesqui en pantalla "DIAGNOSTICS SUCCESSFULLY COMPLETED".

4-Si es vol programar algun mètode, botons de "PROGAMME MODE".

5-Si es vol córrer un gel, botons "REAL CONDITIONS".

6-Treure gels de la gelera.

7-Posar una gota d'aigua enmig de l'espai enquadrat.

8-Treure el gel (amb la coberta de plàstic) amb unes pinces.

9-Doblegar la llengueta i posar el número d'identificació del gel darrera.

10-Posar el gel coincidint amb les retxes vermelles.

11-Llevar bimbolles i eixugar l'aigua sobrant amb un troç de paper absorbent.

12-Llevar pel.lícula de plàstic!.

13-Tancar.

14-"SEP START".

15-"NUMBER OF GELS" 1-2 DO.

16-"START SEP METHOD" (1-->IEF 3-9, 7-->IEF 4-6.5, ETC) DO.

17-Abans de que soni l'alarma s'han d'haver posat les mostres. Sinó s'ha fet "SEP PAUSE".

18-Preparació de mostres.

Tallar un tros de parafilm, posar-lo damunt el motlle i pressionar amb el dit gros, o amb la punta del llapis, a fi de que quedin marcats els pouets, però tenint cura de que no es foradi.

Posar 3-5 ml de mostra a cada pouet. Alerta amb les bimbolles!.

Agafar una pinta de 8 i col.locar-la damunt les mostres, perpendicularment, només que toqui les gotes. Les dues dents dels extrems no han de tocar les mostres.

Assegurar-se de que a cada dent hi ha mostra i de que no n'hi ha als espais intermedis.

Sense girar gens la pinta anar a posar-la al Phastsystem.

19- "SEP PAUSE" . Obrir i posar la pinta, sense pressionar, a l'ànode,càtode o enmig (depè,n de la proteïna).

20-Tancar. "SEP CONTINUE".

21-Després de l'alarma baixen les mostres.

22-El procés es pot seguir per la pantalla.

23-Quan s'acaba sona l'alarma, si,no treus el gel, segueix corrent, per a evitar la difusió.

24-"SEP START/STOP". DO.

25-Quan posa 0v 0.0 mA 0.0 W pots treure el gel. Alerta a no tocar mai la part superior (La pinta es pot treure ara, o quan comença el pas 7.3).

1.a-CONDICIONS ESPECIFIQUES PER A LA PI i la TF

Mostres: Sèrum o plasma fresc o congelat. (En el cas de la TF es pot fer incubació prèvia amb Sulfat Ferròs Amònic 0.5% (1:2). 24h 4o C).

Posició d'aplicació de les mostres: enmig.

IEF: L'indicat al nº 100 del manual. Programa 7.

Gels: pH 4-6.5.

1.b-CONDICIONS ESPECIFIQUES PER A LA GC

Mostres: Sèrum o plasma fresc o congelat.

Posició d'aplicació de les mostres: càtode (-).

IEF: Programa 8. Canvia el paràmetre Vh (450) respecte del 7.

Gels: pH 4-6.5.

2- REVELAT

1- El revelat es pot fer amb l'aparell o fora, com un enzim normal.

2- Si és Coomasie Blue: Treure protector de plàstic de la cubeta de revelat. Posar gels dins la cubeta. La cara del gel sempre cap per avall. Si se'n té un es posa a la part de darrera dels ferros.

3-Tancar la cubeta i posar cadascun dels tubs amb les solucions de revelat corresponents.

4-"DEV START".

5- "START DEV METHOD" 1 ó 3.

6-Comença el mètode, es pot seguir per pantalla. Si hi ha algun problema (falta alguna solució, s'embussa un tub, etc) sona l'alarma i et diu que passa.

7- No avisa amb alarma quan acaba. A la pantalla surt METHOD DONE.

8- Obrir cubeta, treure el gel sense tocar-lo damunt i posar-lo a eixugar a un lloc a on no li toqui fins el dia següent, es pot eixugar també amb un secador.

2.a-CONDICIONS ESPECIFIQUES DE LA PI i TF.

L'indicat al nº 200 del manual. Programa 1 ó 3.

SOLUCIONS:

INCUBACIO: 0.5 gr/100ml d'aigua.

FIXADOR: 33 ml de metanol + 67 d'aigua destil.lada + 180 ml d'àcid Sulfosalicílic.

SOLUCIO DE RENTAT: 90 ml metanol+ 30 ml acètic + 180 ml aigua. D'aquests 300 ml, 100 van a la botella 2, 100 a la botella 4, i 90 al revelador.

REVELADOR: 90 ml de solució de rentat + 10 ml Stock + 0.1 gr de Sulfat de Cu.

STOCK: 80 ml d'aigua + pastilla de PhastGel Blue R. Agitar 5-10'. Afegir 120 ml metanol i agitar 2 minuts. Tapar amb paper de plata.

2.b-CONDICIONS ESPECIFIQUES PER A LA GC

1-Diluir l'anti-Gc 1:4 en aigua (50 ml:150ml).

2-Posar l'anticós sobre el gel, i incubar 30' a 37o C en càmara humida.

3-Rentar 5h en PBS.

4-Tinció igual que la Pi però amb fixador diferent.

SOLUCIONS:

FIXADOR: 20 gr de Acid Tricloroacètic en 100 ml d'aigua destil.lada.

PBS: 0.9% ClNa 100 ml

1.5% K Cl 4ml

1.2%Ca Cl2 3ml

2.1%KH2PO4 1ml

3.8%MgSO4.7H2O 1ml

1.3%NaHCO3 21ml

pH: 7.2-7.7

3- RENTAT DE L'APARELL.

La part de separació es fa neta manualment, amb aigua destil.lada, i s'eixuga bé.

La part de tinció es fa neta amb el programa nº 9:

1- Posar protector de plàstic.

2- Posar tots els tubs dins un frascó amb 750 cc d'aigua destil.lada, excepte el nº 0 que segueix a la botella 0.

3-"DEV START".

4-"START METHOD NUMBER" 9 (RENTAT). DO.

5-Esperar fins que posi "METHOD 9 DONE".

6-Deixar els tubs dins aigua fins la propera vegada que s'empri.

7-Apagar l'aparell (Darrera).

8-Desconectar endolls.

INTERPRETACIO DELS RESULTATS.

Segons el zimograma donat a la introducció es determinarà el genotip de cadascuna de les mostres. Es calcularan també les frequencies fenotípiques i gèniques seguint el mètode de recompte de gens (Veure grups sanguinis).

3.-TECNIQUES D'ELECTROFORESI HORITZONTAL EN GELS DE MIDO: HAPTOGLOBINA

L'haptoglobina és una a2-globina sèrica que presenta la capacitat díunir-se a l'hemoglobina lliure formant complexos estables. La seva funció fisiològica, encara que no és ben coneguda, pareix que és unir-se a l'hemoglobina alliberada per la destrucció dels eritròcits i transportar el complex resultant al fetge perquè es degradi.

Tècniques electroforètiques

L'electroforesi es realitza en gels de midó (Starch potato de Sigma). Per a la preparació del gel s'empra un tampó específic pel sistema enzimàtic que s'ha d'analitzar, i midó hidrolitzat a una concentració del 11%.

Es preparen 400 ml de tampó, se li afegeix el midó (44 gr), es prepara una emulsió que s'encalenteix fins que s'aconsegueix la gelificació. Es sotmet al buit durant 2 minuts aproximadament fins que no queden bimbolles d'aire al gel, i s'aboca sobre una placa d'electroforesi, preparada segons la mida del gel que es vol fer. Es deixa refredar (15' a temperatura ambient, i 30' a 4o C).

Preparació de les mostres

De cada mostra de sèrum a analitzat se'n agafen 12 ml i es mesclen amb 3 ml de sèrum dins un tub eppendorf. Després es col.loca dins cada tub una petita tira de paper Whatman nº 3 de 0.4 x 0.6 cm (absorció aproximada de 20 ml dde mostra). En el gel, una vegada solidificat, es fan un tall horitzontal a 5 cm de l'extrem. Dins ell es col.loquen els papers Whatman amb mostra. Perquè les mostres estiguin alineades, i que les distàncies siguin constants, es sol emprar una regla que se col.loca damunt el gel a uns 5 cm d'un dels extrems. Per a poder seguir la marxa del front es basta fixar-nos, en aquest cas, amb l'hemoglobina.

Electroforesi

La placa de gel amb les mostres col.locades, es disposa damunt dues cubetes de metracrilat que contenen el tampó d'electrodes, es cobreix el gel amb un plàstic transparent, per evitar la seva deshidratació, i es realitzen els ponts (amb esponges tipus Spontex). Es submergeixen els electrodes de platí dins les cubetes, tenint esment a que la migració sigui en sentit correcte, és a dir, cap a l'ànode (pol +). Es conecta la font a un voltatge de 250 volts (corrent contínua, ALERTA!) que corresponen a una intensitat aproximada de 150 miliamperis durant un temps de 3 hores (o el necessari perquè l'hemoglobina corri anòdicament entre 6 i 7 cm).

Tampons:

Gel: 0.076 M Tris Cubetes: 0.3 M ÀC. BÒRIC

0.005 M Ac. Cítric 0.05 M NaOH

pH= 8.6 pH= 8.6

Tinció: Es talla el gel per la meitat passant un fil tibant entre els marcs de metacrilat que delimiten el gel, i es tenyeixen les dues cares internes del gel.

APLICACIÓ: RevelatGE: INCUBACIÓ: Lectura:

Immersió Benzidina 0.03 M Àc. acètic glacial H2O2 30% 5ë To ambient Bandes blaves sobre fons blanc.

38 8.6 0.2

ml ml ml

4.-POLIMORFISME DE L'ADN MITOCONDRIAL (ADNmt) D'ESPECIES DE DROSOPHILA

Protocol d'extracció de l'ADNmt

Preparar un bany a 65°C.

Preparar gel picat.

1.- Col.locar uns 15 individus en un tub eppendorf refredat en gel picat.

2.- Afegir 320 ml de la disolució I i homogeneïtzar de manera suau (mantenint el tub dins gel).

3.- Afegir 400ml de disolució II (acabada de preparar), agitar un poc amb el vórtex, i incubar a 65°C durant 30 minuts (tapar els tubs amb parafilm perquè no es destapin).

4.- Afegir 120 ml d'acetat potàssic 3M (pH=4,8) i deixar uns 12 minuts a -20°C.

5.- Centrifugar en una Eppendorf`durant 10 minuts.

6.- Transferir el sobrenedant (uns 750 ml) i centrifugar 5 minuts.

7.- Transferir el sobrenedant (uns 700 ml) a un nou tub eppendorf i afegir el mateix volum d'alcohol isopropílic. Deixar-ho a temperatura ambient uns 5 minuts (precipita l'ADN).

8.- Llavors es centrifuga durant 5 minuts i queda un precipitat d'ADN que es renta amb 500 ml d'etanol al 70% centrifugant uns 2 minuts.

9.- Es decanta l'alcohol i el tub es deixa eixugar fins que el precipitat està sec.

10.- Es resuspèn el precipitat amb 250 ml de disolució III acabada de preparar i es deixa a temperatura ambient durant 30 minuts o més (aquí es pot aturar).

11.- S'afegeixen 250 ml d'aigua bidestil.lada estèril i es centrifuga 5 minuts.

12.- Al sobrenedant (400-500 ml) s'hi afegeix 1/10 del volum d'acetat potàssic 3 M (40-50 ml).

13.- Afegir 2 volums (0,8-1 ml) d'etanol fred (-20°C), es mescla tot i es deixa a -20°C durant 10 minuts.

14.- L'ADN precipitat es pot recollir centrifugant 5 minuts.

15.- El precipitat es renta amb 0,8 ml d'etanol al 70% (no fred) centrifugant 5 minuts.

16.- Després es decanta el sobrenedant, i per eliminar els restes d'alcohol s'eixuga durant 30 minuts al buit. Quan està sec es resuspèn en 40 ml de tampó TE (es pot guardar a 4°C una nit).

17.- Abans de realitzar la digestió s'ha de centrifugar 5 minuts.

Digestió amb enzims de restricció.

La mescla de digestió consisteix en :

10x tampó de d'enzim de restricció ................... 2.0 ml

ADNmt .................................................................... depèn de l'enzim

2ng/ml d'ARNasa (de 50 ng/ml) ........................ 0.8 ml

10 unitats enzim de restricció .............................depèn de l'enzim

20 ml volum final

1.- Mesclar bé amb la pipeta. Donar un cop de centrífuga.

2.- Incubar 2 hores a 37°C ( millor si es deixa tota la nit).

3.- Per aturar la reacció de digestió :

- cop de centrífuga

- afegir 1 ml d'EDTA 0.5 M ( no és necessari si l'electroforesi es fa tot d'una).

Es pot guardar en gel o a 4°C un parell de dies.

Electroforesi en gels d'agarosa.

Preparació del gel : es prepara un gel a l'1%

1 g d'agarosa

90 ml d'aigua destil.lada

10 ml de TBE 10x

Afegir l'agarosa a l'aigua destil.lada i posar-ho a bullir. Deixar-ho refredar fins que estigui a uns 60°C i afegir el TBE. Posar el gel dins la plantilla i deixar-lo refredar (una hora aproximadament).

Per fer-lo córrer es col.loquen 9 ml d'ADNmt (ja digerit) i 2 ml de colorant BPB a un tub eppendorf; es mescla amb un cop de centrífuga i es col.loquen en els pouets del gel.

A la cubeta d'electroforesi s'hi posa tampó TBE 1x.

El gel es sotmet a un corrent contínuu de 100-150 volts, i es deixa que les mostres corrin fins a unes 3/4 parts del gel (durant 1 hora i mitja o dues).

Per visualitzar-ho es tenyeix amb bromur d'etidi durant uns 30 minut, i es mira amb un transil.liminador UV. La tinció amb bromur d'etidi consisteix en posar el gel en una concentració de 0.5 mg/ml, per la qual cosa es posen 25 ml de bromur d'etidi (d'un stock de 10 mg/ml) dins 500 ml d'aigua detil.lada.

Bibliografia

SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F., i MANIATIS, T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Segona edició.

CAS 1.-

Marcador Mare Suposat Pare Filla Exclusió

AB0 OO A- AO

MNSs MNss MNss NNss

Kell kckc kckc kckc

P1 P1p2 p2p2 p2p2

Duffy bb ab ab

Lewis Le- Le- Le-

Secretor Se- Se- Se-

Pi M1M1 M1M1 M1M1

Tf C1C2 C1C1 C1C2

Gc 11 22 12

ORM F1S F1S F1S

HP 22 12 22

Rh D-ccee ddCcee D-ccee

ESD 11 11 11

ACP AA BB AB

KIDD ab ab aa

-------------------------------------------------------------------------------------------------

ADN FINGERPRINTING

Marcador Bandes maternes Bandes paternes Exclusió

SNAP Hinf I 4 5

PROBABILITAT ACUMULADA D'EXCLUSIO DE PATERNITAT A PRIORI: %.

PROBABILITAT D'ASSIGNACIO POSITIVA DE PATERNITAT: %.

CAS 2.-

Marcador Mare Suposat Pare Fill Exclusió

GRUP AL.LEL FRE.GENIQUES Pr.Excl. a priori

Tf 17.87

C1 .832+.014

C2 .156+.013

C3 .012+.004

B .000

D .000

Pi 31.34

M1+3 .851+.013

M2 .074+.010

S .052+.008

Z .015+.004

F .008+.003

Gc 14.4

1 .75

2 .25

ORM 18.67

F1 .540

F2 .027

S .433

ABO 14.1

A .280

B .056

0 .654

RH 27.9

CDE .069

CDe .410

Cde .017

cDE .071

cDe .054

cde .377

MNSs 31.1(18.75MN,16.5Ss)

M .517

N .483

S .334

s .666

MS .227

Ms .290

NS .107

Ns .375

KELL 3.5

K .067

kc .933

P1 2.9

P1 .441

p2 .559

LEWIS 1.2

Le .552

le .448

DUFFY 17.8

Fya .369

Fyb .621

ESD 9.5

1 .858

2 .142

PGM 31.9

1+ .621

1- .114

2+ .211

2- .054

SE 2.8

Se .506

se .494

KIDD 18.7

A .537

B .463

ACP 23.3

A .324

B .624

C .052

HP 18.2

1 .394

2 .506